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    本發明係揭露一種新穎之長效升糖素共軛物，其中，該升糖素或其衍生物係經由非胜肽之連結基共價鍵結至聚合物載體，以及包括該長效升糖素共軛物作為有效成分之用於預防與治療肥胖之醫藥組成物。由於當本發明之長效升糖素共軛物與抗肥胖藥物組合使用時顯示增進之體內持久性和安定性，且在不會造成如血中葡萄糖濃度波動之任何副作用下，可能會對體重之流失和攝取食物之減少誘發協同效果。據此，本發明之長效升糖素共軛物對於預防和治療肥胖非常有效。
    公开号:TW201309323A
    申请号:TW100125894
    申请日:2011-07-21
    公开日:2013-03-01
    发明作者:Young-Eun Woo；Jong-Soo Lee；Ling-Ai Shen；Dae-Jin Kim；Sung-Youb Jung；In-Young Choi；Se-Chang Kwon
    申请人:Hanmi Science Co Ltd；
    IPC主号:A61K47-00
    专利说明:
    新穎之長效升糖素共軛物及包含其用於肥胖預防與治療之醫藥組成物
    本發明係有關一種新穎之長效升糖素共軛物及一種包含該長效升糖素共軛物之用於預防與治療肥胖之醫藥組成物。更具體地，本發明係有關一種新穎之長效升糖素共軛物，其中，該升糖素或其衍生物係經由非胜肽之連結基共價鍵結至聚合物載體，以及包括該長效升糖素共軛物作為有效成分之用於肥胖預防與治療之醫藥組成物。由於當本發明之長效升糖素共軛物與抗肥胖藥物組合使用時顯示增進之體內持久性和安定性，且在不會造成如血中葡萄糖濃度波動之任何副作用下，可能會顯著地減少共投藥藥物之劑量且展現較佳之藥物遵從性(drug compliance)。據此，本發明之長效升糖素共軛物對於肥胖預防和治療非常有效。
    最近伴隨經濟發展和生活型態改變飲食習慣已巨大改變。特別地，當今忙碌的人由於高卡路里飲食和不足的運動而呈過重和肥胖。世界衛生組織(WHO)已公佈全世界有超過一億位成人是過重的，其中三百萬人經臨床診斷為重度肥胖，而且每年有25,000人死於過重或肥胖相關疾病(World Health Organization,Global Strategy on Diet,Physical Activity and Health,2004)。
    過重和肥胖會增高血壓和血中膽固醇濃度，而增加多種成人疾病如心臟病、糖尿病、關節炎等之風險。又，過重和肥胖為誘發成人疾病如動脈硬化、高血壓、高血脂症和小孩與青少年之心臟病之主因之一。
    肥胖目前被視為全世界流行之嚴重疾病，而且其為多種疾病之原因，而且並非容易治療者。醫療專家認為肥胖不僅是自我控制之問題，而是與食慾控制和能量代謝緊密相關之複雜疾病。肥胖是由於相對於能量消耗量，攝取過量之能量所致。在個人層次上，過量食物能量攝取和缺乏身體活動之組合被認為可解釋肥胖之大部分案例。因此，長期來看，急需發展可與食療和身體活動組合併用時，在預防和治療肥胖方面有效且安全之藥物。
    於目前肥胖的醫療研究中，業已高度重視衍生自前升糖素(pre-glucagen)且可鍵結至GLP-1和升糖素受體二者之調酸素。業已積極研究發展以調酸素之此種雙重功能為基準之抗肥胖藥物。
    類升糖素之胜肽-1(後文中簡稱為"GLP-1")為一種發展中之藥物，其係針對糖尿病患者之高血糖症，且具有增加胰島素之合成和分泌、減少升糖素分泌、抑制胃排空、增強葡萄糖之利用以及減少食物攝取等各種生理作用。又，由蜥蜴毒液所分泌且顯示和GLP-1有約50%同源性之艾塞那肽(exendin)-4係已知會藉由活化GLP-1受體而緩解糖尿病患者之高血糖症。
    當血糖濃度由於如藥物治療、疾病、激素或酶酵素缺乏症而下降至太低，胰臟會分泌升糖素。升糖素發出信號通知肝臟將肝糖分解為葡萄糖，以及將更多葡萄糖釋放至血液流中，造成血糖濃度上升。
    對於作用為GLP-1受體和升糖素受體兩者之促效劑，調酸素具有如GLP-1之減少食物攝取和如升糖素之消化肝醣之作用，因此有作為抗肥胖劑之可能性。
    至於調酸素衍生物，有第一期臨床試驗中之雙重促效劑胜肽(Merck)和臨床前試驗中之ZP2929(Zealand，WO200/8152403A1)。雙重促效劑胜肽(Merck)為調酸素衍生物，其對二胜肽胜肽酶-IV(後文中簡稱為"DDP-IV")之抗性係藉由將第二個胺基酸L-Ser以D-Ser取代，而血中半衰期則係藉由將膽固醇部分(moiety)共軛至其C端點而延長。ZP2929(Zealand)為調酸素衍生物，其包含將第二個胺基酸L-Ser以D-Ser取代以增加對DPP-IV之抗性、第17個胺基酸Arg以Ala取代以增加DPP-IV對蛋白水解酶之抗性、第27個胺基酸Met以Lys取代以增加氧化安定性、及將第20和第24個胺基酸Gln和第28個胺基酸Asp分別以Asp、Aln及Ser取代以增加脫醯胺安定性。
    調酸素作用於GLP-1受體和升糖素受體兩者之能力提供發展抗肥胖劑之可能性。然而，調酸素在醫療用途之問題為極短之半衰期(8至12分鐘)。雙重促效劑調酸素之血中半衰期雖然較天然型調酸素長，惟在體內仍只維持短暫如7小時。又，其投藥劑量高達數mg/kg。因此，目前所用之調酸素或其衍生物由於半衰期短和效力低而有必須以高劑量每日投藥之缺點。在包括此類胜肽作為有效成分之蛋白藥物之情況下，必須經常經由注射而投予藥物以維持適當的血中濃度和力價，這對於患者而言是非常麻煩的。因此，維持高血中濃度和適當力價是發展有效的抗肥胖藥物的必要條件。
    同時，業經進行多次嘗試使藥物力價最大化以長時間改善蛋白藥物之血中安定性和維持其高血中濃度。為了達成此目的，已發展一種以聚合物(如聚乙二醇(PEG))化學修飾藥物之表面之方法。然而，該方法具有PEG之分子量越高，其與目標蛋白質之反應性越低，造成聚乙二醇化產率降低。或者，國際專利公開案第WO02/46227號描述藉由使目標蛋白質經由基因重組而與人類血清白蛋白或免疫球蛋白區(Fc)耦合而製備之融合蛋白。美國專利案第6,756,480號描述藉由使副甲狀腺激素(PTH)及其類似物與Fc區耦合而製備之Fc融合蛋白。此等方法可針對如低聚乙二醇產率和非特異性之問題，但彼等仍有增加血中半衰期之效果並非如預期地為顯著的，間或有力價亦低之問題。為了使增加血中半衰期的效果最大化，使用多種胜肽連結基，但可能引起免疫反應。又，若使用具有二硫鍵之胜肽，則有高的可能性會錯誤摺疊(misfolding)。
    為了解決此等問題，本發明者已建議一種長效蛋白共軛物，其係生理活性之胜肽和免疫球蛋白Fc片段經由胜肽連結基彼此鍵結而成者，從而在維持藥物活性損失之下改善血中安定性(韓國專利案第10-0725315)。特別地，其中由艾塞那肽-4或其衍生物經由非胜肽之連結基共價鍵結至免疫球蛋白Fc片段之長效艾塞那肽-4共軛物顯示延長之體內持久性(韓國專利早期公開案第10-2008-0064750號)。
    另，本發明者已試著將長效艾塞那肽-4共軛物應用於發展具改善之體內持久性和安定性之抗肥胖藥物。於此方面，將長效艾塞那肽-4共軛物(每週一次)和天然型升糖素(每日一次)組合投藥，以同時刺激GLP-1受體和升糖素受體兩者。當與天然型升糖素組合投藥時，長效艾塞那肽-4相較於當單獨投藥時，係帶來意外的體重消失。然而，該共投藥造成血糖濃度之嚴重波動，於受試動物中顯示毒性。
    本發明者因此已努力發展一種增加升糖素之血中半衰期且維持其體內活性之方法，以及發明一種新穎之長效生糖素共軛物(其中該升糖素或其衍生物係經由非胜肽之連結基共價鍵結至聚合物載體如免疫球蛋白Fc片段)。本發明之長效升糖素共軛物顯示改善之體內持久性和安定性。因此，當與抗肥胖藥物組合使用時，本發明之長效升糖素共軛物能以顯著的低劑量有效率地減少體重和食物攝取。又，此共投藥在不會引起血糖濃度嚴重波動之下，展現較佳的藥物遵從性。因此，本發明之長效升糖素共軛物能有效地用於預防和治療肥胖。
    本發明之一目的為提供一種具有改善之體內持久性和安定性之長效升糖素共軛物。
    本發明之另一目的為提供一種製備長效升糖素共軛物之方法。
    本發明之再一目的為提供一種用於預防和治療肥胖之醫藥組成物，該醫藥組成物包括長效升糖素共軛物作為有效成分。
    本發明之再一目的為提供一種用於預防或治療肥胖之方法，該方法包括將醫藥組成物投藥至需要之個體。
    本發明之又一目的為提供一種以長效升糖素共軛物製造用於預防或治療肥胖之藥劑之用途。
    根據其一個態樣，本發明提供一種新穎之長效升糖素共軛物，其中該升糖素或其衍生物係經由非胜肽之連結基共價鍵結至聚合物載體者。
    如本文中使用，術語"升糖素"意指從胰島之阿法細胞(α-細胞)合成和分泌之多胜肽激素，其係由SEQ ID NO: 1之29個胺基酸所組成。升糖素幫助維持血中的葡萄糖濃度。升糖素發出信號通知肝臟將肝糖分解成葡萄糖並釋放入血液流中。又，升糖素刺激胰島素之分泌，而使葡萄糖被胰島素依賴型組織吸收並利用。因此，升糖素和胰島素為將血糖濃度維持在穩定水平之回饋系統之一部分。
    本文中使用之術語"升糖素衍生物"意指與升糖素受體結合且引發與升糖素相同之生物活性之物質。升糖素衍生物具有與天然型升糖素至少80%同源性之胺基酸序列，且可包含某些胺基酸殘基之化學取代、移除或修飾。適合本發明之升糖素可選自天然型升糖素之促效劑、衍生物、片段及變異物及其組合。
    如本文中使用，術語"升糖素促效劑"意指無關於升糖素之結構，能結合至升糖素受體且顯示與生糖素相同之生理活性之物質。
    本文中使用之術語"升糖素衍生物"意指顯示升糖素活性之胜肽，其具有與天然型升糖素至少80%相同之胺基酸序列，且可包含在某些胺基酸殘基之化學取代(例如，α-甲基化、α-羥基化)、移除(例如，去胺化)或修飾(例如，N-甲基化)。
    本文中使用，術語"升糖素片段"意指具有升糖素活性之胜肽，其中至少一個胺基酸係添加至天然型升糖素之N-或C-端或自其N-或C-端移除者。升糖素衍生物亦可為於其中添加非天然存在之胺基酸(例如，D-胺基酸)之胜肽。
    如本文中使用，術語"升糖素變異型"意指具有升糖素活性之胜肽，其中至少一個胺基酸序列不同於天然型升糖素者。
    較佳地，本發明之升糖素衍生物可藉由取代、移除或修飾天然型升糖素之至少一個N-端胺基酸而製備，且可為選自由具有升糖素活性之胜肽及其片段和變異物所組成之群組。更佳地，升糖素衍生物可為其中天然型升糖素之第1個N-端胺基酸組胺酸之α-碳或其連接之胺基可經取代、修飾或移除之胜肽。最佳地，本發明之升糖素衍生物可選自由其中天然型升糖素之N-端胺基經移除之胜肽；其中天然型升糖素之N-端胺基經羥基取代之胜肽；其中天然型升糖素之N-端胺基經兩個甲基修飾之胜肽；以及其中其N-端組胺酸之α-碳和其連接之胺基均經移除之胜肽所組成之群組。
    適合本發明之升糖素衍生物可由以下式1至4表示。


    其中，"胜肽"表示天然型升糖素。
    式1之升糖素衍生物為天然型升糖素中之N-端胺基經移除之D-胺基酸-組胺醯基升糖素(後文中稱為"DA-升糖素")。
    式2之升糖素衍生物為天然型升糖素中之N-端胺基經羥基取代之β-羥基-咪唑丙醯基升糖素(後文中稱為"HY-升糖素")。
    式3之升糖素衍生物為天然型升糖素中之N-端胺基經2個甲基修飾之二甲基組胺醯基升糖素(後文中稱為"DM-升糖素")。
    式4之升糖素衍生物為天然型升糖素中之N-端組胺酸之α-碳和其連接之胺基經移除之咪唑乙醯基升糖素(後文中稱為"CA-升糖素")。
    如本文中使用，術語"長效升糖素共軛物"意指升糖素或升糖物衍生物經由非胜肽之連結基以共價鍵結至聚合物載體，該共軛物具有延長之血中半衰期及增進之體內活性。本發明之長效升糖素共軛物，與天然型升糖素或其衍生物相較，具有增進10%以上之血中半衰期，較佳為增進50%以上。
    本文中，術語"非胜肱之連結基"意指生物相容性聚合物，其包含藉由胜肽鍵以外之任何共價鍵彼此鍵結之兩個或更多個重複單元。由於適合本發明之非胜肽之連結基包含其兩端之官能基，其一端可共價鍵結至升糖素或其衍生物，以及其另一端可共價鍵結至聚合物載體。
    適合本發明之非胜肽之連結基可包含聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇之共聚物、聚氧基乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、生物分解性聚合物如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸羥基乙酸)、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸等等，但並不限於此。較佳地，聚乙二醇可用於作為非胜肽之連結基。
    藉由傳統同義融合(in-frame fusion)方法所獲得之用於融合蛋白中之胜肽之連結基具有容易於體內經由蛋白水解酶裂解之缺點，且因此無法如預期獲得增加胜肽藥物之血中半衰期之足夠效果。然而，本發明使用之對蛋白水解酶有抗性之非胜肽之連結基，可使胜肽藥物之血中半衰期維持在高水平。因此，只要對蛋白水解酶活性具有抗性，非胜肽連結基之種類並無限制。
    較佳地，適合本發明之非胜肽之連結基具有1至100 kDa，更佳為1至20 kDa之分子量。又，本發明之非胜肽之連結基可為一種聚合物或不同種類聚合物之組合。
    適合本發明之非胜肽之連結基於其兩端具有官能基。非胜肽之連結基較佳係選自由乙醛、丙醛、丁醛、馬來醯亞胺以及丁二醯亞胺衍生物所組成之群組。適合本發明之丁二醯亞胺衍生物可包含丙酸丁二醯亞胺酯、羥基丁二醯亞胺基、丁二醯亞胺基羧甲基以及碳酸丁二醯亞胺酯，但並不限於此。特別地，當非胜肽之連結基於兩端具有乙醛基時，可在最小的非特異性反應下，分別將升糖素或其衍生物與聚合物載體有效的鍵結至兩端。又，相較於通過醯胺基鍵結，通過醛基之鍵結更為穩定。
    於非胜肽連結基之兩端之官能基可為相同或相異。例如，非胜肽之連結基可於一端包含馬來醯亞胺，以及於另一端包含乙醛基、丙醛基或丁醛基。當兩端為具有羥基之PEG係用為非胜肽之連結基時，可藉由已知的化學反應使羥基活化成各種官能基。或者，可使用市售之兩端具有經修飾之官能基之PEG。
    本發明之非胜肽之連結基可鍵結至升糖素或其衍生物之多個位置，所得產物顯示之不同活性係取決於它們間鍵結之位置。例如，非胜肽之連結基可鍵結至胜肽之N-端或其他位置如N-端以外之C-端，造成體內活性的差異。非胜肽連結基之乙醛基於低pH下可與升糖素或其衍生物選擇性地反應，而在高pH(例如，pH 9.0)下可與升糖素或其衍生物之離胺酸殘基形成共價鍵結。此聚乙二醇化係在不同的pH條件進行，且所產生之異構物可藉由離子交換管柱層析法從反應混合物分離。
    當非胜肽之連結基鍵結至胜肽N-端以外之對於體內活性重要的其他位置時，在欲修飾之胜肽之胺基酸殘基中導入硫醇基，使得胜肽之硫醇基與非胜肽連結基之馬來醯亞胺可能形成鍵結。
    又，當非胜肽之連結基鍵結至胜肽N-端以外之對於體內活性重要之其他位置時，在欲修飾之胜肽之胺基酸殘基中導入胺基，有可能使胜肽之胺基與非胜肽連結基之乙醯基形成鍵結。
    非胜肽連結基之乙醯基可與存在於升糖素之N-端和第12個離胺酸殘基反應。於本文，胜肽之修飾型可用於選擇性地增加反應產率。例如，胜肽可藉由阻斷其N-端而在期望之位置上僅保留一個胺基，將離胺酸殘基以其他胺基酸取代，將胺基導入C-端等等加以修飾。通過此修飾，有可能增加聚乙二醇化之產率和非胜肽之連結基和胜肽間之耦合反應產率。胜肽之N-端可由多種烷化法如二甲基化、甲基化、去胺化以及乙醯化進行阻斷，但並不限於此。
    於本發明之較佳具體例中，長效升糖素共軛物具有聚合物載體經由非胜肽之連結基共價鍵結至天然型升糖素或其衍生物之胺基，而非其N-端之結構，且同時維持與升糖素受體之鍵結力。
    如本文中所使用，術語"聚合物載體"意指鍵結至藥物致使增加、減少或除去藥物生理活性之物質。然而，關於本發明之目的，聚合物載體係增加升糖素或其衍生物之體內安定性，同時使其生理活性之減少最小化。適合本發明之聚合物載體可包含聚乙二醇(PEG)、聚胺基酸、白蛋白、明膠、免疫球蛋白片段、聚葡萄糖、脂肪酸、多醣以及聚合物，但並不限於此。較佳為使用免疫球蛋白Fc片段作為聚合物載體。
    免疫球蛋白Fc片段係安全使用為藥物載體，因為其為可於身體中代謝之生物可分解性多胜肽。又，免疫球蛋白Fc片段相對於整個免疫球蛋白分子，具有相對低的分子量，因此有利於製備、純化以及產生共軛物。由於免疫球蛋白Fc片段不含有Fab片段，顯示在減少引起抗原性時顯著地增加同質性。
    如本文中所使用，術語"免疫球蛋白(IgG)Fc片段"意指含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)和重鏈恆定區3(CH3)而非免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之可變區，重鏈恆定區1(CH1)和輕鏈恆定區1(CL1)之蛋白質。其可進一步包含在重鏈恆定區之絞鏈(hinge)區。又，本發明之IgG Fc片段可為其含有重鏈恆定區1(CH1)及/或輕鏈恆定區1(CL1)之全部或部分，而不含重鏈及輕鏈之可變區之擴展型，只要具有與天然型實質上類似或更佳之生理功能即可。此外，IgG Fc片段可為其中胺基酸序列之相對長部分對應CH2及/或CH3區域之片段。亦即，本發明之IgG Fc片段可包含1)CH1區域、CH2區域、CH3區域以及CH4區域，2)CH1區域和CH2區域，3)CH1區域和CH3區域，4)CH2區域和CH3區域，5)上述一個或多個區域與IgG絞鏈區(或該絞鏈區之一部分)之組合，以及6)重鏈恆定區和輕鏈恆定區之各區域之二聚物。
    本發明之IgG Fc片段可包含天然型胺基酸序列及其序列衍生物(突變型)。如本文中所使用，術語“序列衍生物”意指由於其一個或多個胺基酸殘基之移除、插入、非保留性取代或非保留性取代或其組合而不同於天然型胺基酸序列者。例如，在IgG Fc之情況下，已知對於結合重要的在第214至238、297至299、318至322或327至331位置之胺基酸殘基可用作此種修飾之適合目標位置。又，此等序列衍生物可藉由移除能形成二硫鍵之位置、從天然型Fc之N-端除去某些胺基酸、或在其N-端導入甲硫胺酸殘基而製備。此外，有可能藉由移除補體結合位置(例如，Clq結合位置)或ADCC(抗體依賴型細胞媒介細胞毒性作用)位置，以移除效應子(effector)功能。此等序列衍生物之製備是本領域中周知的，例如，於國際專利公開案第WO 97/34631和WO 96/32478號中。
    蛋白質和胜肽中之胺基酸交換通常不會改變蛋白質或胜肽之活性，為本領域中已知者(H. Neurath,R. L. Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常發生的交換為在Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly二方互換。
    此外，若期望，Fc片段可藉由磷酸化、硫酸化、丙烯醯化、糖基化、甲基化、法尼基化(farnesylation)、乙醯化、醯胺化等修飾。
    前述Fc衍生物為具有和本發明之Fc片段相同之生理活性或改善的結構安定性例如，對抗熱、pH等之衍生物。
    此外，該等Fc片段可為從單離自人類及其他動物，包含牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠及天竺鼠之天然型獲得的Fc片段，或可為轉型之動物細胞或微生物獲得之重組型或其衍生物。本文中，Fc片段可藉由將全分子免疫球蛋白自人類或動物有機體單離，並以蛋白分解酶處理之天然型免疫球蛋白而獲。木瓜蛋白酶將天然型免疫球蛋白分解成Fab和Fc片段，而胃蛋白酶處理造成pFc’和F(ab’)2片段之產生。可對該等片段進行如尺寸篩除層析法以單離Fc或pFc’。較佳地，源自人類之Fc片段是自微生物之重組型免疫球蛋白Fc片段獲得。
    此外，本發明之免疫球蛋白Fc片段可為具有天然型糖鏈者，相較於天然型增加糖鏈者或相較於天然型減少糖鏈者、或可為去糖化型者。免疫球蛋白Fc糖鏈之增加、減少或移除可藉由本領域中常見之方法而達成，如化學法、酵素法以及利用微生物之基因工程法。自Fc片段移除糖鏈造成對於第一補體成分Cl之Clq部分之結合親和力大幅下降及抗體依賴型細胞媒介細胞毒性作用(ADCC)或補體依賴型細胞毒性作用(CDC)之減少或喪失，而不會誘發體內不必要的免疫反應。於這方面，去糖基化或無糖基化型之免疫球蛋白Fc片段作為藥物載體更適合本發明之目的。
    如本文中所使用，術語"去糖基化"意指自Fc片段酵素性移除糖部分(moiety)，以及術語"無糖基化"意指在原核生物(較佳為大腸桿菌)中生產之未糖基化型之Fc片段。
    在另一方面，免疫球蛋白Fc片段可衍生自人類或其他動物，包含牛、山羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠以及天竺鼠，而且較佳為人類。此外，免疫球蛋白Fc片段可為衍生自IgG、IgA、IgD、IgE以及IgM者、或為其組合或其雜合物(hybrid)。較佳地，其係衍生自人類血液中含量最多的蛋白IgG或IgM，最佳為衍生自已知係加強配位體結合蛋白之半衰期之IgG。
    在另一方面，如本文中所使用，術語"組合物"表示編碼相同來源之單鏈免疫球蛋白Fc區之多胜肽係鍵結至不同來源之單鏈多胜肽以形成二聚體或多聚體。亦即，二聚體或多聚體可由選自由IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc以及IgG4 Fc片段所組成群組之兩個或更多個片段形成。
    如本文中所使用，術語"雜合物"表示編碼兩個或更多個不同來源之免疫球蛋白Fc片段之序列係存在於單鏈免疫球蛋白Fc片段中。在本發明中，可能有各種雜合物。亦即，區域雜合物可由選自由IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc以及IgG4 Fc之CH1、CH2、CH3以及CH4所組成群組之一個至四個區域所構成，亦可包含絞鏈區。
    在另一方面，IgG分類為IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4子類，而且本發明包含其組合物和雜合物。較佳為IgG2和IgG4子類，而且最佳為罕見之具有效子功能如CDC(補體依賴型細胞毒性作用)之IgG4之Fc片段。
    亦即，作為本發明之藥物載體，最佳之免疫球蛋白Fc片段為衍生自人類IgG4之非糖基化之Fc片段。衍生自人類之Fc片段較衍生自非人類之Fc片段更佳，衍生自非人類之Fc片段可能在人體內作用為抗原且引起不期望之免疫反應如製造對抗該抗原之新抗體。
    於較佳具體例中，根據本發明之長效升糖素共軛物可以下式5表示：
    【式5】
    R1-X-Y-Z-R2
    式中，R1係為選自由組胺酸(His)、D-胺基-組胺醯基、N-二甲基-組胺醯基、β-羥基咪唑丙基以及4-咪唑乙醯基所組成之群組；R2為選自由-NH2、-OH以及離胺酸(Lys)所組成之群組；X為SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT；Y為聚乙二醇(PEG)；Z為免疫球蛋白Fc片段。
    於根據本發明之較佳具體例之長效升糖素共軛物中，PEG之兩端分別共價鍵結至CA-升糖素之第12個離胺酸(Lys 12)(亦即，式5中之R1為4-咪唑乙醯基)以及免疫球蛋白Fc片段之N-端。
    根據另一個態樣，本發明提供一種用於製備長效升糖素共軛物之方法。
    本發明之方法包括：
    1)使兩端具有官能基之非胜肽之連結基與天然型升糖素或其衍生物反應；
    2)從步驟1)之反應混合物分離其中天然型升糖素或其衍生物共價鍵結至該非胜肽連結基一端之複合體；
    3)使步驟2)中分離之複合體與該聚合物載體反應；以及
    4)從步驟3)之反應混合物分離其中非胜肽之連結基之一端共價鍵結至天然型升糖素或其衍生物，而另一端共價鍵結至聚合物載體者。
    如本文中所使用，術語"複合體"意指一種中間產物，其中天然型升糖素或其衍生物係共價鍵結至非胜肽連結基之一端者。根據本發明之方法，該複合體將於非胜肽連結基之另一端與聚合物載體之間形成共價鍵。
    於步驟1)中，升糖素或其衍生物與非胜肽之連結基反應，以於其間形成複合體。於此步驟中，可使用具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列之天然型升糖素或其衍生物。該衍生物之實例可包括其中天然型升糖素之N-端胺基經移除之式1之DA-升糖素；其中其N-端胺基經羥基取代之式2之HY-升糖素；其中其N-端胺基經兩個甲基修飾之式3之DM-升糖素；以及其中其N-端組胺酸之α-碳和連接至該α-碳之胺基經移除之式4之Ca-升糖素。
    步驟1)中所使用之非胜肽之連結基在兩端具有官能基。非胜肽連結基之官能基較佳為選自由乙醛、丙醛、丁醛、馬來醯亞胺、丁二醯亞胺衍生物所組成之群組。適合本發明之丁二醯亞胺衍生物之實例可包含丙酸丁二醯亞胺酯、羥基丁二醯亞胺基、丁二醯亞胺基羧甲基以及碳酸丁二醯亞胺酯，但並不限於此。在非胜肽連結基之兩端的官能基可為相同或相異。較佳地，兩端具有乙醛基之PEG係用作非胜肽之連結基。此非胜肽連結基之乙醛基有效於將升糖素或其衍生物和聚合物載體分別鍵結至其兩端，同時使非特異性反應減到最少。又，相較於通過醯胺基鍵結，通過乙醛基鍵結更為安定。
    於步驟1)中，非胜肽之連結基可共價鍵結至天然型升糖素或其衍生物之N-端以外的胺基酸殘基，較佳為第12個離胺酸殘基。於步驟1中，使升糖素或其衍生物和非胜肽之連結基於pH 7.5至10.0，較佳為pH 9.0進行反應，可使非胜肽之連結基選擇性地鍵結至N-端以外的胺基酸殘基較佳為第12個離胺酸殘基。於此處，升糖素或其衍生物與非胜肽之連結基之莫耳比可為1：5至1：50，較佳為1：20至1：30之範圍內。於步驟1)中，使用其N-端經移除或保護之升糖素衍生物有效於防止非胜肽之連結基與其N-端鍵結。
    步驟1)中之反應取決於非胜肽之連結基兩端之官能基種類，可視需要地在還原劑之存在下進行。還原劑之較佳實例可包含氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、硼氫化鈉、二甲基胺硼烷以及吡啶硼烷，但並不限於此。
    於步驟2)中，將其中升糖素或其衍生物係共價鍵結至非胜肽連結基之一端的升糖素-非胜肽連結基之複合體自步驟1)之反應混合物分離。步驟2)中分離之複合體具有升糖素-非胜肽連結基之結構。考慮到所得產物之期望特性如純度、分子量和費用，可根據傳統上用於單離蛋白質之適當方法進行分離步驟。例如，可使用尺寸篩除層析法或離子交換層析法。若需要，可能採用複數種不同的方法，以高純度分離所得之產物。
    於步驟3)中，使在步驟2)中分離之升糖素-非胜肽連結基之複合體與聚合物載體反應，以將聚合物載體以共價鍵鍵結至非胜肽連結基之暴露端。可用於此步驟之聚合物載體可選自由聚乙二醇(PEG)、聚胺基酸、白蛋白、明膠、免疫球蛋白片段、聚葡萄糖、脂肪酸、多醣及巨分子聚合物所組成之群組，但並不限於此。較佳為使用免疫球蛋白(IgG)Fc片段作為聚合物載體。
    於此步驟中，複合體和聚合物載體以在1：2至1：10，較佳為1：4至1：8莫耳比之範圍內，在5.0至8.0之pH範圍內，較佳在pH6進行反應。若需要，取決於非胜肽連結基兩端之官能基種類而定，反應可在還原劑之存在下進行。還原劑之較佳實例可包含氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、硼氫化鈉、二甲基胺硼烷以及吡啶硼烷，但並不限於此。
    於步驟4)中，將其中非胜肽之連結基之一端共價鍵結至升糖素或其衍生物且另一端共價鍵結至聚合物載體的長效升糖素共軛物自步驟3)之反應混合物分離。考慮到所得產物之期望特性如純度、分子量和費用，可根據傳統上用於單離蛋白質之適當方法進行分離步驟。例如，可使用尺寸篩除層析法或離子交換層析法。若需要，可能採用複數種不同的方法，以高純度分離所得之產物。
    於較佳之具體例中，本發明之製備方法包括：
    1)使在兩端各具有乙醛基之PEG與式4之升糖素衍生物於pH 9.0反應；
    2)從步驟1)之反應混合物分離其中PEG之一端共價鍵結至升糖素衍生物之第12個離胺酸殘基之升糖素衍生物-PEG複合體；
    3)使步驟2)中分離之該升糖素-PEG複合體與免疫球蛋白Fc片段反應；以及
    4)從步驟3)之反應混合物分離其中PEG之一端共價鍵結至該升糖素衍生物，以及另一端鍵結至該免疫球蛋白Fc片段之長效升糖素共軛物。
    根據又一態樣，本發明提供一種用於預防或治療肥胖之醫藥組成物，其包括長效升糖素共軛物作為有效成分。
    如本文中所使用，術語"肥胖"意指過剩體脂肪已由於能量不平衡而堆積之健康狀態或疾病。投藥根據本發明之醫藥組成物可顯著地降低體重和減少食物攝取，導致肥胖之預防或治療。
    如本文中所使用，"預防"意指投藥根據本發明之醫藥組成物所造成之抑制或遲緩肥胖開始之任何作用。
    如本文中所使用，"治療"意指投藥根據本發明之組成物所造成之肥胖症狀之改善或有利之改變之任何作用。
    由於本發明之醫藥組成物包括具有延長血中半衰期和改善之體內持久性和安定性之長效升糖素共軛物作為有效成分，期望可降低藥物之投藥劑量，在無血糖濃度波動下改善藥物遵從性，藉以有效地預防和治療肥胖。
    本發明之醫藥組成物除了本發明之長效升糖素共軛物之外，可進一步包括抗肥胖藥物作為有效成分。
    適合與本發明之長效升糖素共軛物組合投藥之抗肥胖藥物之實例可包含GLP-1促效劑、肥胖激素(leptin)促效劑、DPP-IV抑制劑、Y5受體拮抗劑、黑色素濃縮激素(MCH)拮抗劑、Y2/3促效劑、MC3/4促效劑、胃脂酶/胰脂酶抑制劑、5HT2c促效劑、β3A促效劑、澱粉素促效劑以及類生長激素(ghrelin)拮抗劑，但並不限於此。
    較佳地，根據本發明之醫藥組成物可進一步包括韓國專利公開案第10-2008-0064750號中揭露之長效艾塞那肽-4共軛物作為抗肥胖藥物。該長效艾塞那肽-4共軛物是由艾塞那肽-4(GenBank登入號AAB22006，SEQ ID NO：2)或其衍生物和經由非胜肽之連結基而彼此共價鍵結之免疫球蛋白Fc片段所構成。於較佳具體例中，選自由其中天然型艾塞那肽-4之N-端胺基經移除之胜肽(DA-艾塞那肽-4)；其中其N-端胺基經羥基取代之胜肽(HY-艾塞那肽-4)；其中N-端胺基經兩個甲基修飾之胜肽(DM-艾塞那肽-4)；以及其中其N-端組胺酸之α-碳和連接於該α-碳之胺基經移除之胜肽(CA-艾塞那肽-4)所組成之群組之艾塞那肽-4衍生物，係經由非胜肽之連結基共價鍵結至免疫球蛋白Fc片段。
    當與抗肥胖藥物組合投藥時，相較於單獨投藥長效升糖素共軛物，本發明之長效升糖素共軛物在體重流失及食物攝取減少方面顯示協同作用。特別地，當本發明之長效升糖素共軛物與長效艾塞那肽-4共軛物組合投藥時，該長效升糖素共軛物作用於升糖素受體，同時抗肥胖藥物作用於GLP-1受體，而更有效率地降低體重和減少食物攝取。由於長效胜肽共軛物之共投藥可顯著地增加血中半衰期和體內持久性、顯示更穩定的血糖濃度波動、以及可相當地減少其劑量，本發明之醫藥組成物非常有效於預防和治療肥胖。
    於較佳具體例中，本發明之長效共軛物與長效艾塞那肽-4共軛物組合投藥至飲食誘發之肥胖(DIO)小鼠，接著監控其體重、食物攝取量及血糖濃度之變化。結果，業經發現相較於僅投藥其中一種藥物，藥物之共投藥顯著地降低體重、有效地抑制食物攝取以及顯示更穩定的血糖濃度波動(參照第1至3圖)。在另一方面，當天然型升糖素與長效艾塞那肽-4共軛物組合投藥時至DIO小鼠時，觀察到體重降低，但血糖濃度激烈波動(參照第4和5圖)。該等結果證實僅當升糖素與艾塞那肽-4均為長效共軛物形式時，方可預期在未引發任何如血糖濃度波動之副作用下，對於體重流失和減少食物攝取量產生協同效果，且由於其體內持久性和安定性而可顯著地降低藥物劑量。
    本發明之醫藥組成物可進一步包括醫藥上可接受之載體。用於口服投藥，醫藥上可接受的載體可包含黏著劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、助溶劑、分散劑、安定劑、懸浮劑、著色劑以及香料。用於注射投藥，醫藥上可接受的載體可包含緩衝劑、保藏劑、鎮痛劑、助溶劑、等張劑以及安定劑。用於局部投藥，醫藥上可接受的載體可包含鹼、赋形劑、潤滑劑以及防腐劑。
    本發明之醫藥組成物可與前述醫藥上可接受的載體組合而調配成各種劑量形式。例如，用於口服投藥，醫藥組成物可調配成錠劑、片劑、膠囊劑、酏劑、懸浮液、漿劑或扁片劑(wafer)。用於注射投藥，醫藥組成物可調配成安瓿，為單一劑量形式或單位劑量形式，例如多劑量容器。醫藥組成物亦可調配成溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊劑及長效製劑。
    在另一方面，適合本發明之醫藥組成物之載體、賦形劑以及稀釋劑之實例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、丁四醇、麥芽糖醇、澱粉、相思樹橡膠、海藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯四氫吡咯酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂以及礦物油。此外，本發明之醫藥組成物可進一步包含填料、抗凝結劑、潤滑劑、潤濕劑、香料以及消毒劑。
    本發明之醫藥組成物可經由任何常見途徑投藥，只要能到達期望的組織即可。業經預期多種投藥模式，包含腹腔、靜脈、肌肉內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內以及直腸內投藥，但並不限於此。
    然而，由於胜肽在口服投藥時即被分解，用於口服投藥之醫藥組成物之有效成分應經包覆或經調配以保護免於受到胃中之降解。較佳地，本發明之醫藥組成物可以注射形式投藥。此外，本發明之醫藥組成物可使用能將有效成分輸送至目標細胞之某裝置投藥。
    本發明之醫藥組成物之投藥頻率和劑量可由許多相關之因素決定，包括欲治療之疾病種類、投藥途徑、患者年齡、性別、體重以及疾病嚴重程度、以及作為有效成分的藥物種類。例如，當與抗肥胖藥物組合使用時，本發明之長效升糖素共軛物可於每週投藥10至4000 μg/kg，較佳為50至2000 μg/kg之劑量，以及長效艾塞那肽-4共軛物可於每週投藥5至100 μg/kg，較佳為10至50 μg/kg之劑量。然而，該劑量可根據投藥途徑、疾病嚴重程度、以及患者性別、以及體重和年齡而增加或減少，因此不會限制本發明之範疇。由於顯示優異的體內持續性和力價，本發明之醫藥組成物之投藥頻率可顯著地減少。由於本發明之醫藥組成物具有優異的體內持久性和安定性且血中半衰期延長，其可顯著地降低投藥頻率和藥物劑量。
    根據又再一個態樣，本發明提供一種用於預防或治療肥胖之方法，包括對需要之個體投藥醫療有效量之長效升糖素共軛物。在此方面，本發明之長效升糖素共軛物可與抗肥胖藥物組合投藥。
    可與長效升糖素共軛物組合投藥之抗肥胖藥物較佳為韓國專利公開案第10-2008-0064750號揭露之長效艾塞那肽-4共軛物。該長效艾塞那肽-4共軛物係由艾塞那肽-4或其衍生物和免疫球蛋白Fc片段經由非胜肽之連結基共價聚集而構成。較佳之長效艾塞那肽-4共軛物，係由選自經由移除艾塞那肽-4之N-端胺基而製備之衍生物(DA-艾塞那肽-4)、經由以羥基取代艾塞那肽-4之N-端胺基而製備之衍生物(HY-艾塞那肽-4)、經由以兩個甲基修飾艾塞那肽-4之N-端胺基而製備之衍生物(DM-艾塞那肽-4)以及經由移除艾塞那肽-4之N-端組氨酸之α-碳和連接於該α-碳之胺基而製備之衍生物(CA-艾塞那肽-4)之艾塞那肽-4衍生物，經由非胜肽之連結基共價鍵結至免疫球蛋白Fc片段者，但本發明並未限定於此。
    如本文中所使用，術語“投藥”意指以適合的方式，將有效成分引進患者中。只要可允許有效成分到達目標組織，可採用任何投藥。投藥途徑包含多種投藥模式，例如包含腹腔、靜脈、肌肉內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內以及直腸內投藥，但並不限於此。然而，由於胜肽在口服投藥時即分解，口服投藥之組成物之有效成分應經包覆或經調配以於在胃中降解。較佳地，有效成分可調配成注射劑。此外，長效共軛物可在任何幫助將有效成分傳遞至目標細胞之設備輔助下投藥。
    欲治療之個體之實例包含人類、猿、牛、馬、綿羊、豬、雞、火雞、鵪鶉、貓、狗、小鼠、大鼠、兔以及天竺鼠，但並不限於此。較佳為哺乳動物。更佳為人類。
    就有效成分說明中所使用之術語"醫療上的有效量"意指足以用於預防或治療疾病之量，亦即，使肥胖在合理的受益/風險之比率下，而能應用於醫學治療。
    當與抗肥胖藥物組合投藥時，本發明之長效升糖素共軛物作用於升糖素受體，且同時，抗肥胖藥物作用於GLP-1受體，藉以在不會造成副作用如血糖濃度之波動下，誘發體重流失和減少食物攝取之協同效果。據此，本發明之長效胜肽共軛物非常有效於預防和治療肥胖。 [有利的功效]
    本發明之長效升糖素共軛物顯示延長之血中半衰期和改善之體內持久性和安定性。因此，當與抗肥胖藥物組合使用時，本發明之長效升糖素共軛物可以在無血糖濃度波動下，以顯著較低之劑量投藥，並且展現改善之藥物遵從性。據此，本發明之長效升糖素共軛物可有效地用於預防或治療肥胖。
    本發明可以通過以下說明闡示之實施例更加了解，但該等實施例不應解釋為限制本發明。 實施例1：咪唑-乙醯基升糖素-免疫球蛋白Fc共軛物之製備
    使咪唑-乙醯基升糖素(CA-升糖素,AP,U.S.A.)與3.4K PropionALD(2) PEG(在兩端具有丙醛基之PEG,IDB Inc.,Korea)反應，以使CA-升糖素之第12個離胺酸殘基(Lys12)聚乙二醇化。於此處，CA-升糖素和PEG之莫耳比為1：30，而且反應係以3mg/ml之胜肽濃度於室溫進行3小時。又，反應係在作為還原劑之20mM SCB之存在下，於100 mM硼酸鈉緩衝液(pH 9.0)中進行。反應完全之後，所得產物CA-升糖素-PEG複合體經由層析法純化，其係使用SOURCE S管柱(XK 16 ml,GE Healthcare)於下列條件下進行：
    管柱：SOURCE S(XY 16 ml,GE Healthcare)
    流動速率：2.0 ml/min
    梯度：以洗提液A 0%→洗提液B 50%洗提50分鐘(A：20 mM檸檬酸,pH 3.0,B：A+1 M KCl)
    將以上經純化之CA-升糖素-PEG複合體與免疫球蛋白(IgG)Fc片段(韓國專利第10-735315號)以1：8之莫耳比混合，接著以20 mg/ml之胜肽濃度於4℃反應20小時。此時，在作為還原劑之20 mM SCB之存在下，使反應於100 mM K-P緩衝液(pH 6.0)中進行。反應完全之後，使反應混合物進行兩步驟之層析，其係使用SOURCE Phe管柱(HR 16 ml,GE Healthcare)和SOURCE Q管柱(XK 16 ml,GE Healthcare)於以下條件進行：
    管柱：SOURCE Phe(HR 16 ml,GE Healthcare)
    流動速率：7.0 ml/min
    梯度：以洗提液A 100%→0%洗提60分鐘(A：20 mM Tris,pH 7.5+2 M NaCl)
    管柱：SOURCE Q(XK 16 ml,GE Healthcare)
    流動速率：2.0 ml/min
    梯度：以洗提液A 0%→洗提液B 20%洗提70分鐘(A：20 mM Tris,pH 9.0,B：A+1 M NaCl)
    首先，使用SOURCE Phe管柱以移除未參與反應之大量IgG Fc。使用20 mM Tris(pH 7.5)和1M NaCl之鹽梯度，較早洗提出具有相對較弱結合親和力之IgGFc，接著洗提出CA-升糖素-PEG-Fc共軛物。通過此第一純化步驟將IgG Fc移除到某種程度，但由於IgG Fc和CA-升糖素-PEG-Fc-共軛物彼此相似的結合親和力，則無法完全從彼此分離。至於第二純化程序，則利用二者間之疏水性差異。使用20 mM Tris(pH 9.0)，使第一純化之樣本耦合至SOURCE Q管柱。接著，使用1M NaCl之鹽梯度洗提。於SOURCE Q管柱中，較早洗提出具有較弱結合親和力之IgG Fc，接著洗提出具有強結合親和力之CA-升糖素-PEG-Fc共軛物。反相HPLC分析之結果，經上述純化之CA-升糖素-PEG-Fc共軛物顯示95.8%之純度。 實施例2：咪唑-乙醯基艾塞那肽-4-免疫球蛋白Fc共軛物之製備
    使咪唑-乙醯基艾塞那肽-4(CA-艾塞那肽-4,AP,U. S. A.)與3.4K PropionALD(2) PEG(在兩端具有丙醛基之PEG,IDB Inc.,Korea)反應，使CA-艾塞那肽-4之第27個離胺酸殘基(Lys27)聚乙二醇化。於此處，CA-艾塞那肽-4和PEG之莫耳比為1：30，而且反應係以3mg/ml之胜肽濃度於4℃進行12小時。又，反應係於作為還原劑之20mM SCB之存在下，於100 mM硼酸鈉緩衝液(pH 9.0)中進行。反應完全之後，所得產物CA-艾塞那肽-4-PEG複合體經由層析法純化，其係使用SOURCE Q管柱(XK 16 ml,GE Healthcare)及SOURCE S管柱(XK 16 ml,GE Healthcare)於下列條件下進行：
    管柱：SOURCE Q(XK 16 ml,GE Healthcare)
    流動速率：2.0 ml/min
    梯度：以洗提液A 0%→洗提液B 20%洗提70分鐘(A：20 mM Tris,pH 9.0,B：A+1 M NaCl)
    管柱：SOURCE S(XK 16 ml,GE Healthcare)
    流動速率：2.0 ml/min
    梯度：以洗提液A 0%→洗提液B 50%洗提50分鐘(A：20 mM檸檬酸,pH 3.0,B：A+1 M KCl)
    詳細而言，單一聚乙二醇化之胜肽主要係通過SOURCE Q管柱純化，隨後通過SOURCE S管柱分離異構物。首先洗提出N-端聚乙二醇化胜肽之尖峰，接著洗提Lys-聚乙二醇化之兩個尖峰。由該兩個Lys-聚乙二醇化尖峰之胜肽圖，顯示較早洗提出的部分為Lys12-聚乙二醇化之複合體，較晚洗提出之部分為Lys27-聚乙二醇化之複合體。
    將如此獲得之Lys27-聚乙二醇化之CA-艾塞那肽-4-PEG複合體與免疫球蛋白Fc片段(韓國專利第10-725315)以1：8之莫耳比混合，隨後使其以20 mg/ml之胜肽濃度於4℃反應20小時。此時，反應係在作為還原劑之20mM SCB之存在下，於100 mM K-P緩衝液(pH 6.0)中進行。反應完全之後，反應混合物經由兩步驟之層析法純化，其係使用SOURCE Q管柱(XK 16 ml,GE Healthcare)及SOURCE ISO管柱(HR 16 ml,GE Healthcare)於下列條件下進行：
    管柱：SOURCE Q(XK 16 ml,GE Healthcare)
    流動速率：2.0 ml/min
    梯度：以洗提液A 0%→洗提液B 20%洗提70分鐘(A：20 Mm Tris,pH 9.0,B：A+1 M NaCl)
    管柱：SOURCE ISO(HR 16 ml,GE Healthcare)
    流動速率：7.0 ml/min
    梯度：以洗提液A 100%→0%洗提60分鐘(A：20 mM Tris,pH 7.5,+1.5 M硫酸銨)
    首先，使用SOURCE Q管柱以移除未參與反應之大量IgG Fc。使用20 mM Tris(pH 7.5)和1M NaCl之鹽梯度，較早洗提出具有相對較弱結合親和力之IgG Fc，接著洗提出CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物。通過此第一純化步驟將IgG Fc移除到某種程度，但由於IgG Fc和CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc-共軛物彼此相似的結合親和力，無法完全從彼此分離。至於第二純化程序，則利用二者間之疏水性差異。使用20 mM Tris(pH 9.0)，使第一純化之樣本耦合至SOURCE ISO管柱。接著，使用1M NaCl之鹽梯度洗提。於SOURCE ISO管柱中，較早洗提出具有較弱結合親和力之IgG Fc，接著洗提出具有強結合親和力之CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物。反相HPLC分析之結果，經上述純化之CA-艾塞那肽-PEG-Fc共軛物顯示91.6%之純度。 實施例3：長效升糖素共軛物與抗肥胖藥物共投藥之協同效果
    為了確認實施例1中製備之長效升糖素共軛物和實施例2中製備之長效艾塞那肽-4-共軛物在共投藥時產生之協同效果，分析飲食誘發之肥胖(DIO)小鼠之體重、食物攝取以及血糖濃度之改變。
    以高脂肪飲食餵食五週齡C57BL/6小鼠(Orient,Korea)13週，藉以獲得飲食誘發之肥胖(DIO)小鼠作為糖尿病模式。詳細而言，根據體重，將小鼠分類為五組G1、G2、G3、G4以及G5組(5隻小鼠/每組)，並且允許自由取用高脂肪飲食(D12492,Research Diets,Inc. New Brunswick,NJ)，同時高脂肪飲食每日以新鮮者交換。五組中之小鼠(其為18週齡，每隻50g)於不同劑量投藥兩週，以載劑作為控制組；另分別投藥CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物(HM1 1260C)；CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物(HM1 1260C)+CA-升糖素；以及CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物(HM1 1260C)+CA-升糖素-PEG-Fc共軛物(LAPS CA-共軛物)。
    於此，至於G2組以20μg/kg之劑量每週投藥CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物一次；至於G3組，以20 μg/kg之劑量每週投藥CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物一次，以及以100 μg/kg之劑量每日投藥CA-升糖素兩次(BID)；至於G4組，以20 μg/kg之劑量每週投藥CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物一次，以及以700 μg/kg之劑量每週投藥CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物一次；至於G5組，以20 μg/kg之劑量每週投藥CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物一次，以及以1400 μg/kg之劑量每週投藥CA-升糖素-PEG-Fc共軛物。
    在投藥各試驗材料之後，每日監控各組中之小鼠之體重、食物攝取以及血糖濃度之改變。
    如第1至3圖中所示，相較於其他組，共投藥長效升糖素共軛物和長效艾塞那肽-4-共軛物之組顯示體重和食物攝取顯著地減少。特別地，共投藥天然型升糖素與長效艾塞那肽-4共軛物之組顯示體重流失，但觀察到血糖濃度之激烈的波動(第4和5圖)。然而，共投藥長效升糖素共軛物與長效艾塞那肽-4共軛物之組展現血糖濃度之穩定波動。
    該等結果暗示僅當升糖素與艾塞那肽-4為長效共軛物之形式時，共投藥方能在血糖濃度無波動下對體重流失和抑制食物攝取誘發協同效果。又，業經發現本發明之長效共軛物由於其延長之血中半衰期和改善之體內持久性而可以顯著地低劑量投藥，因此可有效地用於預防或治療肥胖。 比較例1：天然型升糖素與抗肥胖藥物之共投藥
    為了確認在天然型升糖素與實施例2中製備之長效艾塞那肽-4-共軛物在共投藥時產生之效果，根據實施例3中所述之相同方法，以不同劑量對飲食誘發肥胖(DIO)之小鼠投藥，以載劑作為控制組(G1)；另分別投藥天然型升糖素胜肽(G2)；CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物(HM1 1260C)(G3)；以及天然型升糖素+CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物(HM1 1260C)投藥兩週。
    於此，至於G2組，以200μg/kg之劑量每日投藥天然型升糖素兩次(BID)；至於G3組，以20μg/kg之劑量每週投藥CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物一次，至於G4組，以200 μg/kg之劑量每日投藥天然型生糖素兩次(BID)，以及以20 μg/kg之劑量每週投藥CA-艾塞那肽-4-PEG-Fc共軛物一次。
    在投藥各試驗材料之後，每日監控各組中小鼠之體重、食物攝取以及血糖濃度之改變。
    如第4和5圖所示，相較於其他組，共投藥天然型升糖素與長效艾塞那肽-4共軛物之組體重降低更多，但觀察到嚴重波動的血糖濃度。
    雖然本發明所揭露之較佳具體例係用於闡示目的，彼等熟悉本領域者將了解可有各種修飾、增加以及取代，而不會悖離附隨之申請專利範圍中所揭露之本發明之範疇和精神。 產業利用性
    本發明之長效升糖素共軛物顯示延長之血中半衰期和改善之體內持久性和安定性。因此，當與抗肥胖藥劑組合使用時，本發明之長效升糖素共軛物可在血中濃度無波動下，以顯著低之劑量投藥，並且展現改善之藥物遵從性。因此，本發明之長效升糖素共軛物可有效地用於預防或治療肥胖。
    <110>　韓美控股股份有限公司
    <120>　新穎之長效升糖素共軛物及包含其用於肥胖預防與治療之醫藥組成物
    <130>　OPA11075/TW
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    <400>　2

    第1圖為顯示在共投藥長效CA-升糖素共軛物和長效CA-艾塞那肽-4共軛物之後8天，DIO(飲食誘發之肥胖)小鼠之體重改變之圖。
    第2圖為顯示在共投藥長效CA-升糖素共軛物和長效CA-艾塞那肽-4共軛物之後8天，DIO(飲食誘發之肥胖)小鼠之食物攝取改變之圖。
    第3圖為顯示在共投藥長效CA-升糖素共軛物和長效CA-艾塞那肽-4共軛物之後8天，DIO(飲食誘發之肥胖)小鼠之血糖濃度改變之圖。
    第4圖為顯示在共投藥天然型升糖素和長效CA-艾塞那肽-4共軛物之後12天，DIO(飲食誘發之肥胖)小鼠之體重改變之圖。
    第5圖為顯示在共投藥天然型升糖素和長效CA-艾塞那肽-4共軛物之後12天，DIO(飲食誘發之肥胖)小鼠之血糖濃度改變之圖。
    該代表圖無元件符號及其代表之意義。
    权利要求:
    Claims (45)
    [1] 一種長效升糖素共軛物，其中之升糖素或升糖素衍生物係經由非胜肽之連結基共價鍵結至聚合物載體者。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物，其中，該升糖素衍生物為天然型升糖素之第一個N-端組胺酸殘基之α-碳或連接至該α-碳之胺基經取代、修飾或移除之衍生物。
    [3] 如申請專利範圍第2項所述之長效升糖素共軛物，其中，該升糖素衍生物係選自由下列各者所組成之群組：其中天然型升糖素之第一個N-端組胺酸殘基之胺基經移除之衍生物；其中其第一個N-端組胺酸殘基之胺基經羥基取代之衍生物；其中其第一個N-端組胺酸殘基之胺基經兩個甲基修飾之衍生物；以及其中其第一個N-端組胺酸殘基之α-碳和其連接之胺基經移除之衍生物。
    [4] 如申請專利範圍第3項所述之長效升糖素共軛物，其中，該升糖素衍生物係選自由下式1至4所組成之群組： 式中，「胜肽」表示天然型升糖素。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物，其中，該非胜肽之連結基之一端係共價鍵結至升糖素或其衍生物，以及其另一端係鍵結至聚合物載體。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物，其中，該非胜肽之連結基係選自由下列各者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇之共聚物、聚氧基乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、聚葡萄糖、聚乙烯基乙基醚、生物分解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、透明質酸以及其等之組合。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物，其中，該非胜肽之連結基具有在1至100 kDa範圍內之分子量。
    [8] 如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物，其中，該非胜肽之連結基在兩端具有官能基，該官能基為相同或相異。
    [9] 如申請專利範圍第8項所述之長效升糖素共軛物，其中，該官能基係選自由下列各者所組成之群組：乙醛、丙醛、丁醛、馬來醯亞胺、丙酸丁二醯亞胺酯、羥基丁二醯亞胺基羧甲基以及碳酸丁二醯亞胺酯。
    [10] 如申請專利範圍第9項所述之長效升糖素共軛物，其中，該非胜肽之連結基在兩端具有乙醛基。
    [11] 如申請專利範圍第10項所述之長效升糖素共軛物，其中，該非胜肽之連結基為在兩端具有乙醛基之聚乙二醇(PEG)。
    [12] 如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物，其中，該聚合物載體係選自由下列各者所組成之群組：聚乙二醇(PEG)、聚胺基酸、白蛋白、明膠、免疫球蛋白片段、聚葡萄糖、脂肪酸、多醣以及巨分子聚合物。
    [13] 如申請專利範圍第12項所述之長效升糖素共軛物，其中，該聚合物載體為免疫球蛋白Fc片段。
    [14] 如申請專利範圍第13項所述之長效升糖素共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc片段係經無糖基化者。
    [15] 如申請專利範圍第13項所述之長效升糖素共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc片段係由選自由下列各者所組成之群組：CH1、CH2、CH3以及CH4區域之一個至四個區域所構成。
    [16] 如申請專利範圍第13項所述之長效升糖素共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc片段進一步包括絞鏈(hinge)區。
    [17] 如申請專利範圍第13項所述之長效升糖素共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc片段係衍生自選自由IgG、IgA、IgD、IgE以及IgM所組成之群組之免疫球蛋白。
    [18] 如申請專利範圍第13項所述之長效升糖素共軛物，其中，該免疫球蛋白Fc片段為IgG4 Fc片段。
    [19] 如申請專利範圍第18項所述之長效升糖素共軛物，其中，該免疫球蛋白為經無糖基化之人類IgG4 Fc片段。
    [20] 如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物，其係具有下式5所示之結構：【式5】R1-X-Y-Z-R2式中，R1為選自由組胺酸(His)、D-胺基-組胺醯基、N-二甲基-組胺醯基、β-羥基咪唑丙基以及4-咪唑乙醯基所組成之群組；R2為選自由-NH2、-OH以及離胺酸(Lys)所組成之群組；X為SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT；Y為聚乙二醇(PEG)；Z為免疫球蛋白Fc片段。
    [21] 一種製備如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物之方法，包括下列步驟：1)使兩端具有官能基之非胜肽之連結基與升糖素或其衍生物反應；2)從步驟1)之反應混合物分離其中該升糖素或其衍生物共價鍵結至該非胜肽連結基一端之複合體；3)使步驟2)中分離之複合體與聚合物載體反應；以及4)從步驟3)之反應混合物分離其中該非胜肽之連結基之一端共價鍵結至該天然型升糖素或其衍生物，以及另一端共價鍵結至該聚合物載體之長效升糖素共軛物。
    [22] 如申請專利範圍第21項所述之方法，其於步驟1)中，該升糖素或其衍生物和該非胜肽之連結基間之反應係以1：5至1：50莫耳比之範圍內於pH7.5至10.0之範圍內進行。
    [23] 如申請專利範圍第21項所述之方法，其於步驟1)中，該升糖素或其衍生物和該非胜肽之連結基間之反應係在還原劑之存在下進行。
    [24] 如申請專利範圍第23項所述之方法，其中，該還原劑係選自由氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、硼氫化鈉、二甲基胺硼烷以及吡啶硼烷所組成之群組者。
    [25] 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中，於步驟2)中分離之該複合體具有升糖素-非胜肽連結基之結構，其中該非胜肽之連結基之一端係共價鍵結至該升糖素或其衍生物之N-端以外之胺基酸殘基者。
    [26] 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中，該胺基酸殘基為該升糖素或其衍生物之第12個離胺酸殘基。
    [27] 如申請專利範圍第21項所述之方法，其於步驟3)中，該複合體與該聚合物載體間之反應係以1：2至1：10之莫耳比於pH5.0至8.0之範圍內進行。
    [28] 如申請專利範圍第21項所述之方法，其於步驟3)中，該複合物與該聚合物載體之反應係在還原劑之存在下進行。
    [29] 如申請專利範圍第28項所述之方法，其中，該還原劑係選自由氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、硼氫化鈉、二甲基胺硼烷以及吡啶硼烷所組成之群組者。
    [30] 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中，於步驟4)分離之該長效升糖素共軛物具有升糖素-非胜肽之連結基-聚合物載體之結構。
    [31] 如申請專利範圍第21項所述之方法，包括以下步驟：1)使在兩端具有乙醛基之PEG與式4之升糖素衍生物於pH 9.0反應；2)從步驟1)之反應混合物分離其中PEG之一端共價鍵結至升糖素衍生物之第12個離胺酸殘基之升糖素衍生物-PEG複合體；3)使步驟2)中分離之該升糖素衍生物-PEG複合體與免疫球蛋白Fc片段反應；以及4)從步驟3)之反應混合物分離其中PEG之一端共價鍵結至升糖素衍生物，以及另一端鍵結至該免疫球蛋白Fc片段。
    [32] 一種用於預防或治療肥胖之醫藥組成物，包括如申請專利範圍第1項所述之長效升糖素共軛物作為有效成分，以及醫藥上可接受之載體。
    [33] 如申請專利範圍第32項所述之醫藥組成物，進一步包括抗肥胖藥物。
    [34] 如申請專利範圍第33項所述之醫藥組成物，其中，該肥胖藥物係選自由下列各者所組成之群組：GLP-1促效劑、肥胖激素促效劑、DPP-IV抑制劑、Y5受體拮抗劑、黑色素濃縮激素(MCH)拮抗劑、Y2/3促效劑、MC3/4促效劑、胃脂酶/胰脂酶抑制劑、5HT2c促效劑、β3A促效劑、澱粉素促效劑、類生長激素(ghrelin)拮抗劑，以及該等之組合者。
    [35] 如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其中，該GLP-1促效劑係選自由艾塞那肽-4、艾塞那肽-4衍生物以及其長效共軛物所組成之群組者。
    [36] 如申請專利範圍第35項所述之醫藥組成物，其中，該艾塞那肽-4衍生物係選自由下列各者所組成之群組：其中天然型艾塞那肽-4之第一個N-端組胺酸殘基之胺基經移除之衍生物；其中其第一個N-端組胺酸殘基之胺基經羥基取代之衍生物；其中其第一個N-端組胺酸殘基之胺基經兩個甲基修飾之衍生物；以及其中其第一個N-端組胺酸殘基之α-碳和其連接之胺基經移除之衍生物。
    [37] 如申請專利範圍第35項所述之醫藥組成物，其中，該長效艾塞那肽-4共軛物具有其中艾塞那肽-4或其衍生物係經由非胜肽之連結基共價鍵結至免疫球蛋白Fc片段者。
    [38] 如申請專利範圍第37項所述之醫藥組成物，其中，該長效艾塞那肽-4共軛物具有其中該非胜肽之連結基之一端係共價鍵結至艾塞那肽-4衍生物，以及另一端係共價鍵結至免疫球蛋白Fc片段之結構，而該艾塞那肽-4衍生物為其中其第一個N-端組胺酸殘基之α-碳和其連接之胺基經移除之衍生物。
    [39] 一種用於預防或治療肥胖之方法，包括對有需要之個體投藥醫療上有效量的如申請專利範圍第1項之長效升糖素共軛物。
    [40] 如申請專利範圍第39項所述之方法，其中，該長效升糖素共軛物係與抗肥胖藥物組合投藥。
    [41] 如申請專利範圍第40項所述之方法，其中，該肥胖藥物係選自由下列各者所組成之群組：GLP-1促效劑、肥胖激素促效劑、DPP-IV抑制劑、Y5受體拮抗劑、黑色素濃縮激素(MCH)拮抗劑、Y2/3促效劑、MC3/4促效劑、胃脂酶/胰脂酶抑制劑、5HT2c促效劑、β3A促效劑、澱粉素促效劑、類生長激素拮抗劑以及其等之組合者。
    [42] 如申請專利範圍第41項所述之方法，其中，該GLP-1促效劑係選自由艾塞那肽-4、艾塞那肽-4衍生物以及其長效共軛物所組成之群組。
    [43] 如申請專利範圍第42項所述之方法，其中，該艾塞那肽-4衍生物係選自由下列各者所組成之群組：其中天然型艾塞那肽-4之第一個N-端組胺酸殘基之胺基經移除之衍生物；其中其第一個N-端組胺酸殘基之胺基經羥基取代之衍生物；其中其第一個N-端組胺酸殘基之胺基經兩個甲基修飾之衍生物；以及其中其第一個N-端組胺酸殘基之α-碳和其連接之胺基經移除之衍生物。
    [44] 如申請專利範圍第42項所述之方法，其中，該長效艾塞那肽-4共軛物具有其中艾塞那肽-4或其衍生物係經由非胜肽之連結基共價鍵結至免疫球蛋白Fc片段之結構。
    [45] 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中，該長效艾塞那肽-4共軛物具有其中該非胜肽之連結基之一端係共價鍵結至艾塞那肽-4衍生物，以及另一端係共價鍵結至免疫球蛋白Fc片段之結構，而該艾塞那肽-4衍生物為其中其第一個N-端組胺酸殘基之α-碳和其連接之胺基經移除之衍生物。
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    公开号 | 公开日
    EP2595648A4|2014-07-02|
    JP2013537525A|2013-10-03|
    US20130122023A1|2013-05-16|
    EP3248611B1|2021-07-21|
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    JP6076902B2|2017-02-08|
    US9072794B2|2015-07-07|
    EP3248611A1|2017-11-29|
    AR082320A1|2012-11-28|
    KR20120010146A|2012-02-02|
    KR101382593B1|2014-04-10|
    TWI593422B|2017-08-01|
    EP2595648A2|2013-05-29|
    WO2012011752A2|2012-01-26|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US10981967B2|2015-12-31|2021-04-20|Hanmi Pharm. Co., Ltd.|Long-acting conjugate of triple glucagon/GLP-1/GIP receptor agonist|
    US11142559B2|2016-06-29|2021-10-12|Hanmi Pharm. Co., Ltd.|Glucagon derivative, conjugate thereof, composition comprising same, and therapeutic use thereof|
    US11261227B2|2015-06-30|2022-03-01|Hanmi Pharm. Co., Ltd.|Glucagon derivative and a composition comprising a long acting conjugate of the same|US5480867A|1993-12-29|1996-01-02|The Rockefeller University|Glucagon analogs with serine replacements|
    US6096871A|1995-04-14|2000-08-01|Genentech, Inc.|Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life|
    WO1997034631A1|1996-03-18|1997-09-25|Board Of Regents, The University Of Texas System|Immunoglobin-like domains with increased half lives|
    US6277375B1|1997-03-03|2001-08-21|Board Of Regents, The University Of Texas System|Immunoglobulin-like domains with increased half-lives|
    US7157555B1|1997-08-08|2007-01-02|Amylin Pharmaceuticals, Inc.|Exendin agonist compounds|
    US6756480B2|2000-04-27|2004-06-29|Amgen Inc.|Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein|
    CN101712722A|2000-12-07|2010-05-26|伊莱利利公司|Glp-1融合蛋白|
    US20050176108A1|2003-03-13|2005-08-11|Young-Min Kim|Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life|
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    CA2658673A1|2005-07-27|2008-02-01|Gerald J. Prud'homme|Composition and method for prevention and treatment of type i and type ii diabetes|
    JP2008169195A|2007-01-05|2008-07-24|Hanmi Pharmaceutical Co Ltd|キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体|
    WO2008152403A1|2007-06-15|2008-12-18|Zealand Pharma A/S|Glucagon analogues|
    JP2009019027A|2007-07-16|2009-01-29|Hanmi Pharmaceutical Co Ltd|アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体|
    JP5669582B2|2007-10-30|2015-02-12|インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ|グルカゴンアンタゴニスト|
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    AR090281A1|2012-03-08|2014-10-29|Hanmi Science Co Ltd|Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo|
    KR101665009B1|2012-03-09|2016-10-11|한미사이언스 주식회사|비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물|
    CN104487082A|2012-04-19|2015-04-01|奥普科生物制品有限公司|长效胃泌酸调节素变体及其生产方法|
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    JP6822839B2|2013-09-13|2021-01-27|ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュート|修飾された治療剤、及びその組成物|
    CA2933701A1|2013-12-18|2015-06-25|The California Institute For Biomedical Research|Modified therapeutic agents, stapled peptide lipid conjugates, and compositions thereof|
    AU2015206890B2|2014-01-20|2019-05-23|Hanmi Pharm. Co., Ltd.|Long-acting insulin and use thereof|
    SG10202107752PA|2014-03-31|2021-09-29|Hanmi Pharm Co Ltd|Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage|
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    KR20100070485||2010-07-21||
    KR20100070484||2010-07-21||
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